如果您实验需要把细胞核或细胞质蛋白单独分离出来，则需要准备相应的试剂。以下以Biovision的K266为例做一个成分和提取步骤的讲解。如果用的是其他品牌的试剂盒，可以参考其说明书进行操作。
| 组分 | K266-25 | K266-100 |
| 25次 | 100次 | |
| Cytosol Extraction Buffer A (CEB-A) | 5ml | 20ml |
| Cytosol Extraction Buffer B (CEB-B) | 300μl | 1.2ml |
| Nuclear Extraction Buffer A (NEB) | 2.5ml | 10ml |
| DTT (1 M) | 100μl | 100μl |
| Protease Inhibitor Cocktail | 1瓶 | 1瓶 |
实验步骤
- 1
- 2
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使用前的准备
(1) 打开试剂盒后，可以将缓冲液储存在4°C或-20°C中，将蛋白酶抑制剂混合物和DTT储存在-20°C中;
(2) 在使用蛋白酶抑制剂之前，加250μl 的DMSO使其充分溶解成500X，后面使用时按1X的比例加入到其他溶液中;
(3) 在开始实验之前，准备好相应的试剂:按1ml 的NEB溶液分别加入2μl 蛋白酶抑制剂和1μl DTT，CEB-A也是按照这个比例加入蛋白酶抑制剂和DTT;
(4) 确保在实验过程中所有缓冲液都置于冰上，所有离心都在4°C下进行。 -
细胞核/质蛋白提取操作步骤
(1) 4°C 600g离心5min收集细胞，一次实验需要2X106个细胞;
(2) 加入0.2 ml 含DTT和蛋白酶抑制剂的CEB-A混合物。如果为组织样本，则取100-200mg的组织切成小块，加1-2 ml 预冷的PBS，然后用组织匀浆机将组织充分打碎，匀浆过程需要在冰上进行。500g离心2-3min沉淀细胞，并去除上清液;
(3) 加入0.2 ml 的CEB-A混合物，剧烈涡旋15s钟使细胞沉淀充分悬浮，将样品在冰上孵育10min;
(4) 加入11μl 预冷的CEB-B，剧烈涡旋5s，在冰上孵育1min;
(5) 剧烈涡旋5s，16,000g 4°C离心5min;
(6) 立即将上清液即细胞质提取物部分转移到另一个预冷的EP管中，-80°C保存备用;
(7) 将沉淀物即含细胞核部分重悬于100 μl 预冷的NEB;
(8) 剧烈涡旋15s，将样品置于冰中，每隔10min剧烈涡旋15秒，共4次;
(9) 16,000g 4°C离心10min;
(10) 立即将上清液即核提取物转移到预冷的EP管中，-80°C保存备用。
* 注意:使用上述步骤制备的核提取物所含蛋白质的浓度约为1 mg/ml。如果需要更高的浓度，可以在步骤(7)中将包含细胞核部分重悬于较小体积的NEB(例如20μl)中。