5.1 抗体孵育过程中需要配制的各种试剂配方

先用TBST配成5%的BSA(W/V，即100ml的溶液加5g的BSA)，作为抗体稀释液备用。

将一抗按照说明书上的比例进行稀释，如1:1000稀释，配10ml抗体即在10ml的BSA抗体稀释液中加入10ul抗体原液。
如果抗体要多次重复使用的话，可以看下抗体原液有没有加叠氮化钠，如果没有加的话，那在抗体稀释的时候可以加上0.01%左右的叠氮化钠作为防腐剂。

将二抗按照说明书上的比例用配好5% BSA的溶液进行稀释，如1:1000稀释，配10ml抗体即在10ml的BSA抗体稀释液中加入10ul抗体原液。

★如果购买的二抗为粉末状，需要提前将抗体稀释好，稀释和保存的方法可参考一下Jackson的二抗重溶和储存注意事项:
①  HRP标记的二抗:不含防腐剂Sodium Azide(叠氮化钠)(会影响HRP活性)
②  荧光基团标记的二抗:含有0.05%叠氮化钠作为防腐剂 重溶和储存:将冻干粉储存在2-8摄氏度。当准备使用时，用一定体积的dH₂O(蒸馏水)溶解(每个抗体重溶的体积不一样，根据说明书)，充分溶解后如果还有浑浊的话可离心。重溶后可在2-8°C稳定放置6周，每次使用时需新鲜配置成需要的工作浓度。重溶后分装放 在零下70度或更低温度可延长储存时间，注意避免反复冻融。或者，可加入等体积的甘油(ACS级或更好)使抗体浓度变成重溶时的50% ，储存在-20°C。

注意:加入甘油后使蛋白质浓度和稀释的范围都减半(比如:重溶后抗体的浓度是0.8mg/ml体积2ml，抗体稀释比例1:5,000-1:100,000 for WB, 加入等体积(2ml)的甘油后，抗体浓度变成0.4mg/ml，体积4ml，抗体稀释比例变成1:2500-1:50000 for WB)。

有效使用期:重溶后的一年. 超期当检测实验结果在可接受范围内，仍可使用!

注意:确保甘油是ACS级别的或者更高的级别，达不到ACS级别的甘油可能严重影响过氧化物酶的活性!

在敷好二抗洗好膜之后，将显影液配制好，显影的A、B液按1:1的比例混合，室温放置，下一步显影用。