实验步骤
- 1
- 2
-
使用前的准备
(1) 试剂盒打开后将缓冲液保存在4°C下，蛋白酶抑制剂和DTT储存在‒20°C下;
(2) 用ddH2O将5X Cytosol Extraction Buffer 稀释成1X;
(3) Mitochondria Extraction Buffer和1X Cytosol Extraction Buffer 在使用前按每1ml加入2μl蛋白酶抑制剂和1μl DTT;
(4) 在实验过程中所有缓冲液都需要置于冰上操作。 -
线粒体蛋白提取操作步骤
(1) 4°C 600g离心5min收集实验处理好的细胞，一次实验所需要细胞数约为5 x 107个;
(2) 用10ml预冷的PBS洗涤细胞，然后4°C 600g离心5min，吸掉上清液;
(3) 用1.0ml的含有DTT和蛋白酶抑制剂的1X Cytosol Extraction Buffer充分重悬细胞，冰上孵育10min;
(4) 在冰上用匀浆机使细胞破碎，匀浆的时间和强度取决于细胞类型，应避免过度均质化，导致线粒体膜破坏，使线粒体成分释放;
(5) 将匀浆好的样品转移至1.5ml EP管中，4°C 700g(3000 rpm)离心10min，收集上清液并丢弃沉淀;
(6) 上清4°C 10,000g离心30min，如果需要胞质组分，则收集上清储存在‒80°C保存备用，沉淀接下来进行线粒体提取;
(7) 如果需要完整的线粒体，将上一步的沉淀重悬于预冷的0.1 ml 1X PBS中。如果需要线粒体蛋白裂解物，则用100μl含有DTT和蛋白酶抑制剂的Mitochondria Extraction Buffer重悬沉淀，涡旋振荡10s，收集的组分则为线粒体蛋白裂解物。