1.1.14  内质网提取

(1)  试剂盒中的各种缓冲液保存在4°C下;

(2)  Isotonic Extraction Buffer 5X中加入4倍体积的超纯水稀释成1X，Hypotonic Extraction Buffer 10X加入9倍体积的超纯水稀释成1X，两个试剂使用之前需要取适量的缓冲液各自加入蛋白酶抑制剂;

(3)  Calcium Chloride Solution试剂盒中的浓度为2.5 M，用超纯水稀释成8 mM CaCl₂溶液，每0.032ml的2.5M 溶液加10ml水稀释，终浓度即为8 mM;

(4)  所有试剂和设备在使用之前需要进行预冷。

A、从动物软组织中提取线粒体:

(1)  取好的新鲜组织放在培养皿中用10ml预冷的PBS洗涤两次，并轻摇几分钟，去除组织上的血液，洗好的组织放在纸巾上，以吸收多余的液体和血液凝块。然后将组织切成1.5‒2cm的小块，再重复洗涤两次，用纸巾吸干组织上多余的液体并称重;

(2)  用手术刀将组织切成0.3-0.5cm的小块，按每克加3.5ml的1X Isotonic Extraction Buffer，用匀浆机把组织充分匀浆，整个过程需要在冰上进行，匀浆完之后如果仪器上沾有较多的组织，可以用0.5ml的1X Isotonic Extraction Buffer将冲洗下来;

(3)  匀浆4°C下1,000g离心10min，小心吸除漂浮的薄薄脂质层，之后将上清液移至另一个离心管中，丢弃沉淀; 

(4)  4°C下12,000g离心15min，通过抽吸小心去除薄薄的漂浮脂质层，将上清液转移到另一个离心管中，弃去沉淀。上清液部分是线粒体等微粒体部分(PMF)，是微粒体的来源;

(5)  在不断搅拌的时候，再向PMF中逐滴添加相当于PMF 7.5倍体积的8 mM的氯化钙溶液，此时CaCl₂的终浓度为7 mM，在4°C下再搅拌15min;

(6)  4°C以8000g离心10min，富集的RER微粒体将在沉淀中，除去上清液，并将沉淀物悬浮在1X Isotonic Extraction Buffer，按每g原始组织加0.3 ml缓冲液充分混匀，收集的组分则为微粒体溶液;接下来采用密度梯度离心法4°C条件下分离内质网。

(7)  用60% OptiPrep Density Gradient Medium稀释微粒体至终浓度为20%，按每毫升样品添加0.5 ml60% OptiPrep Density Gradi-ent Medium，充分混匀;

(8)  取一个8ml的超速离心管，并在底部放置2ml的30% OptiPrep Density Gradient Medium; 

(9)  在巴斯德移液器的帮助下，通过将含20% OptiPrep Density Gradient Medium的样品以液滴小心地滴在靠近底层的管壁上让它自己沿着壁流下去，最多加1.5 ml样品在30%溶液的上部;

(10)  借助巴斯德移液器，小心地将4ml的15%OptiPrep Density Gradient Medium溶液铺在样品上，滴在靠近底层的管壁上让它自己沿着壁流下去;

(11)  封闭试管，在离心机上配平好，4°C 150,000g离心3h; 

(12)  离心结束后，用胶带将校准刻度尺贴在试管的侧面，使上弯月面与校准线重合，用4英寸钝头针头和适当尺寸的注射器从梯度的顶部向下抽取0.5ml的馏分，将针头的末端插入第一条校准线的底部，并取出等分试样，记录抽取的体积，将馏分转移到微量离心管中; 

(13)  将针移至下一条校准线的底部，以相同的方式继续抽取馏分，将每个馏分转移到新的微量离心管，中间层为含有内质网的组分，保存标记装有样品的试管，进行接下来的分析。

B、从培养的细胞中提取内质网(细胞数量> 2 x 10⁸个):

(1)  收集培养的细胞，将细胞在600g下离心5min，丢弃上清;

(2)  加入10倍体积的PBS对细胞进行洗涤并离心;

(3)  将细胞悬浮在相当于细胞沉淀3倍体积的1X Hypotonic Extraction Buffer equivalent 中，并在4°C下孵育20min，使细胞充分膨胀破裂;

(4)  600g下离心5min，然后吸掉上清，保留沉淀;

(5)  加入大约跟沉淀等体积的1XIsotonic Extraction Buffer equivalent ，将样品转移至7 ml Dounce均质器中; 

(6)  用Dounce匀浆器充分使细胞完全破碎，接下来采用密度梯度离心法4°C条件下分离内质网;

(7)  用60% OptiPrep Density Gradient Medium稀释微粒体至终浓度为20%，按每毫升样品添加0.5 ml 60% OptiPrep Density Gradi-ent Medium，充分混匀;

(8)  取一个8ml的超速离心管，并在底部放置2ml的30% OptiPrep Density Gradient Medium; 

(9)  在巴斯德移液器的帮助下，通过将含20% OptiPrep Density Gradient Medium的样品以液滴小心地滴在靠近底层的管壁上让它自己沿着壁流下去，最多加1.5ml样品在30%溶液的上部;

(10)  借助巴斯德移液器，小心地将4ml的15%OptiPrep Density Gradient Medium溶液铺在样品上，滴在靠近底层的管壁上让它自己沿着壁流下去;

(11)  封闭试管，在离心机上配平好，4°C 150,000g离心3h;

(12)  离心结束后，用胶带将校准刻度尺贴在试管的侧面，使上弯月面与校准线重合，用4英寸钝头针头和适当尺寸的注射器从梯度的顶部向下抽取0.5ml的馏分，将针头的末端插入第一条校准线的底部，并取出等分试样，记录抽取的体积，将馏分转移到微量离心管中;

(13)  将针移至下一条校准线的底部，以相同的方式继续抽取馏分，将每个馏分转移到新的微量离心管，中间层为含有内质网的组分， 保存标记装有样品的试管，进行接下来的分析。