2× Xerox PCR Master Mix

2×Xerox PCR Master Mix是用高保真聚合酶Xerox DNA 聚合酶配制而成的2倍PCR预混液，包含了PCR反应中除引物和模板以外的其它所有组分。优化了反应体系的PCR预混液可以得到更稳定的扩增结果。  Xerox DNA 聚合酶是一种高保真的热稳定DNA聚合酶，用于快速高保真PCR扩增。在镁离子存在的条件下，该酶可催化三磷酸脱氧核苷酸沿5‘→3’方向发生聚合反应，合成DNA。它还具有校正功能的3’→5’外切酶活性。 Xerox DNA 聚合酶扩增得到的产物为平末端,可以直接克隆于平末端克隆载体或加A尾克隆于普通T载体中。Xerox DNA 聚合酶具有更高的保真性（保真性是Taq DNA 聚合酶的至少50倍，为Pfu DNA 聚合酶的6倍），更快的DNA合成速度（15-30sec/kb）和更强的扩增能力。

Xerox DNA 聚合酶具有的很高热稳定性，可以用 98℃预变性，对于大多数模板而言，98℃预变性 1 min 就足够了，预变性不要超出 3 min。当然也可以按照常规方法使用 94℃变性 2-5 min。血液直接扩增时，预变性可设置 95℃ 10 min，让细胞裂解并释放DNA。

在循环扩增时，98℃变性持续时间可以设定 5-10sec，简单模板 5sec，复杂模板 10sec。

一般条件下，可以采用如上表所列的三温度梯度循环的 PCR 扩增方法，引物的退火温度为两条引物中较低 Tm-5，引物的退火持续时间可以设定 10-20 sec。当两条引物的 Tm 值都大于等于 70℃时，而且都使用了长引物，可以使用两步法来扩增，两步法中退火温度和延伸温度都为 72℃。

Xerox DNA 聚合酶的最佳延伸温度是 72℃。延伸所需要的时间依赖于扩增产物的长度和复杂度。对于质粒，BAC 这类

简单模板，可以使用 15 sec/kb 延伸速度，对于高复杂性的基因组 DNA，可以使用 30sec/kb 延伸速度。扩增 1kb 以下的产物时，延伸时间不要超过 40 sec。

扩增模板：
1.低复杂基因组模板（质粒、病毒、λ和 BAC DNA 等）,50 μl 体系中添加 5-10 ng。为获得更高保真性的扩增产物，高浓度模板和少量 PCR 循环数组合是一个较好的方法。

2.高复杂基因组模板，50 μl 反应体系中，DNA 模板的使用量应该在 100-500 ng，如果扩增的片段较长，最好用琼脂糖电泳检测 DNA的完整性。DNA 的完整性越好，长距离 PCR 的成功率越高。

3.cDNA 模板的添加量不要超过 PCR 反应体系的 1/10,50 μl PCR 反应体系中 RT 产物的加入量为 2-3μl，不要超过 5μl。


PCR循环设置：

PCR 反应结束后，5-10μl 扩增产物用含 0.5μg/ml 溴化乙锭（或合适浓度的其它 DNA 染色试剂），合适浓度的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳完成后在紫外透射仪下观察并记录结果。