- 1、Flowjo如何快速协助数据的统计分析
- 2、什么！你的Flowjo插件R语言运行又出bug了？
- 3、没想到吧！Flowjo还有这样的功能~
- 4、Flowjo图像展示方式的合理选择与适用情况（上）
- 5、Flowjo图像展示方式的合理选择与适用情况（下）
1、Flowjo如何快速协助数据的统计分析（点击返回目录）
在流式结果分析中，我们除了要导出分析好的流式图结果，更重要的是导出数据做统计分析，以便于去发现样本之间的差异趋势。
基本操作我们 “五小只第二十回”刚刚介绍过，大家可以再去回顾一下（点击图片查看）：
今天要强调的是，流式数据比较形式并非单一，不同的情景可能需要比较不同类型的数据去进行后续统计，如：
l 细胞群占上一圈门层级的百分比
l 某特殊细胞群占总体或某一圈门层级的百分比
l 对某些指标的平均荧光强度进行比较
我们平时数据导出时，显示的百分比默认为当前细胞群，占上一圈门层级的百分比：
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那其他这些参数要怎么算呢？Excel一个个手动算么？
Flowjo有好用的Add Statistics功能哦！
△点击放大图片
选中细胞群体，鼠标点击右键也可找到
△点击放大图片
这里就可以添加我们常用的统计数据类型了：
平均荧光强度（MFI）、百分比、CV值、SD值
△点击放大图片
①MFI值的添加
可以选择：Median, Mean, Geometric Mean, Mode
②百分比的添加
可以选择：
l Freq.of Parent：此圈门内细胞群占上一层级的比例。
l Freq.of Grandparent: 此圈门内细胞群占上级隔层门群体的比例。
l Freq.of Total:此圈门内细胞群占收集总细胞的比例。
l Freq.of _ : 自定义比例计算，此圈门内占某一层级群体的比例，可以通过Choose进行选择。
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③CV值的添加
就选择CV即可，表示该数据的变异系数（仪器检测到的信号均一性），CV越小变异越少，数据越可靠。
④SD值的添加
数据的标准差，就选择SD即可，即为对应通道上荧光强度的标准差，但我们一般统计不涉及该参数的计算，而是基于样本数量，在把所有样本数据进行输出的时候自动计算的。如图，使用Table Editor批量导出数据时自动计算得到的。
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以上就是Flowjo的数据添加Add Statistics功能的基本使用介绍啦，大家学会了吗？
2、什么！你的Flowjo插件R语言运行又出bug了？（点击返回目录）
Q:罗工，我的这批流式数据，利用Flowjo的质检功能检查后，发现结果很是不美丽，想用之前你讲座提到的Flowjo插件里的FlowAI功能清除一下这些不良数据，可就是运行不了呢，明明按照你们的网站视频教程和以前共享的R语言代码弄得，咋就是不对呢？是不是我R语言装的不对啊，罗工快来救救孩子吧o(╥﹏╥)o
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罗工：哈哈，肯定是R语言安装问题。但是Flowjo插件早就不用R语言喽！
罗工：你肯定是最近忙实验，都没留意我的朋友圈flowjo最新消息~out了吧！
Q:What？我错过了这么重要的爆炸性信息，快教教我，咋弄？
罗工：去Flowjo官网插件下载界面
https://www.flowjo.com/exchange/#/，下载个PluginPlay
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罗工：再在右上角小心心的设置菜单中的Diagnostics里面关联下当前保存位置就O了~
△点击放大图片
罗工：就跟安装其他插件一样。
Q:Amazing！这是新出的插件吧，该不会只有最新版本的10.8.1的Flowjo版本才能用吧？
罗工：不用，10.6.2以上的版本都能用。
Q:就没啥安装要求或者使用的注意事项？
罗工：插件的保存路径不要有中文就行了，其他就没啥了，都不要求保存在Flowjo安装路径里了呢。
Q:那其他那几个需要R语言的插件呢，这个都能一起解决？
罗工：对，这个PluginPlay Bundle插件，就相当于是一个嵌合好了R语言的插件合集安装包，一键安装后，包括FlowAI，FlowClean，FlowSOM，CytoNorm，IndexSort和ViolinBox的插件就都装好了。
Q:牛哇，又get到了新技能，我这就去搞起，感谢罗工！
3、没想到吧！Flowjo还有这样的功能~（点击返回目录）
之前我们介绍过如何用Flowjo批量导出图片，及一些基础操作：
（点击可查看对应文章）
【罗工流式秘籍33】宝，你看今天的图；什么图？flowjo批量导出的流式图
【罗工流式秘籍38】流式图“七十二变”-graph definition
那么除了导出常规的图像进行分析和部分展示外，我们肯定也想要得到在文献里常见的这种流式圈门逻辑图：
△点击放大图片
可是很多老师不会使用Photoshop等软件进行图片编辑，怎么办呢？
其实，在Flowjo的Layout editor的图片编辑器里，也完全可以轻松实现哦~
Step 1：添加箭头
①在功能框选中直线工具，在界面画一条直线
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②选中直线，右键弹出的选项框中，最下端Arrow Style即可添加箭头
△点击放大图片
③选中直线后，可在Object中，调节粗细，种类，颜色，阴影和角度等参数
△点击放大图片
Step 2：坐标轴参数调整
①双击流式图，在Annotate里可以对图像展示内容进行取舍，及对坐标轴的展示的内容进行自定义，比如坐标轴改名，坐标或者刻度展示与否等
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②在Fonts里能对图像展示信息的字体、字号、颜色等进行编辑
△点击放大图片
③同样的，点击选中图像后，在Object功能里也能对图像的边框、方向、线条细节和阴影等进行调整
△点击放大图片
④编辑图片后，还可使用快捷工具，添加文字标注和各种形状
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4、Flowjo图像展示方式的合理选择与适用情况（上）（点击返回目录）
Flowjo自带的流式图像展示方式有很多种，在结果良好的情况下，用哪种图片展示其实都是可以的，没有显著区别。
本期开始我们针对每种图形类型的优缺点和适用角度逐一进行解说：
△点击放大图片
①散点图（Dot Plot）
可以简单的理解为细胞多的地方，点就密集一些，细胞少的地方，看着就松散一些
散点图设置这里有一个空格，可以手动调整当前散点图中显示的细胞数量
当我们同一批次实验样本，收取的数据Events数差异过大，图像展示出来时一个样本数据显著稀少，那这个时候我们就可以考虑把它改成这种散点图去规避掉质疑
除此之外，散点图也可以选不同的背景及细胞群的展示颜色，能起到一定的美观效果（请忽略小编的配色审美）
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②密度图（Density Plot）
他是表现与数据值对应的边界或域对象的一种理论图形表示方法，以整个细胞的分布密度，形成这种雾蒙蒙的图。
他的优点就是可以比较好的看到细胞的分群情况。
且在密度图上面我们也有些选项，来对密度图进行一定的修饰。
选择smooth可以让密度图进行一个边缘光滑性的处理，将杂细胞排除。
也可以选择show outliers让周边细胞以散点的形式展示出来。
也可以像散点图一样进行颜色的修饰。
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△点击放大图片
△点击放大图片
但密度图有很多升级的用法，一般直接使用密度图展示结果的文献并不是很多.
未完待续... ...
更多详细内容，可观看视频版讲解：
5、Flowjo图像展示方式的合理选择与适用情况（下）（点击返回目录）
上期已经给大家介绍了流式结果图呈现方式的转化，及2种展示图的使用，这期我们接着说余下的几种。
③等高线图（Countor Plot）
将细胞以等高线的形式进行排列，细胞密度大的地方，它的等高线就会越高。
等高线图右边的level值可以调节来改变小伙伴们对结果呈现的需求。
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△点击放大图片
我们常用等高线图来弥补收集的目的细胞很少，导致的结果展示上的瑕疵。
如下如左，对亚群的比例进行展示时，这个结果图其实就已经非常不好看了，这时选择等高线图是可以遮盖掉这个瑕疵的。
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④斑马图（Zebra Plot）
它是密度图和等高线图的组合形式，其优势为可以将一些分群不清晰的细胞群，展示的比散点图或者其他图更加明显。
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⑤伪彩图（Pseudocolour）
伪彩图分2种主要展示形式，其中第1种是软件默认的结果输出图，也是我们大多数人最常用的。
它就是在散点图的基础上，额外添加热力颜色，通过颜色的深浅展示细胞的密度，相当于散点图和密度图的融合。
第2种伪彩图形式，可通过直接点击右键，选择smooth选项进行切换，类似斑马图，能够让我们更好的分开细胞群落，同时又保留了密度图的热力颜色，现在有很多的文章中都是以第2种伪彩图去展示流式结果的。
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⑥其他
a三维图，会有一个Z轴，Z轴的荧光强度以这种热力颜色的方式进行展示。
b我们很常见的，单参数直方图，但这种展示方式，除非细胞群分的很清晰，不然往往容易造成一定的困扰，常规并不太推荐使用。
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c现在也有更好的高维数据的展示方式，经过一些算法分析之后的降维的展示方式，比如像t-SNE就是对高维多参数同时展现在一张图里的结果。
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更多详细内容，可观看视频版本讲解：
