引言
特殊临床病人的血，往往很难以收集，从少量的血液中，尽可能多的分离目的免疫细胞，对我们的研究还是有很大的益处的。
本文借助文献、工作中的操作经验及不同试剂的品牌商的咨询，为大家整理了，如何从一管人的血液样本中，分离淋巴、单核、中性粒细胞和血清样本，其中包含PBMC的制备步骤，针对只需要PBMC的老师，也可以借鉴一下。
整体流程图如下：
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一、准备工作：
温度设置：离心机18-22℃，室温最好也可以控制在这个范围，所有试剂提前拿出复温
主要试剂：
Ficoll-Paque PLUS（浓度1.077，17144002，Cytiva）
红细胞（RBC）裂解缓冲液（自配，或555899，BD）
HBSS（0.5 M EDTA）和PBS（0.5 M EDTA）
注：
①此方法，主要建立在Ficoll分离 PBMC技术上。温度低于最佳温度，会导致Ficoll密度增加，进而增加PBMC层的红细胞和粒细胞的污染，及最下面的沉淀层粒细胞的减少。温度高于最佳温度，会导致Ficoll密度减小，进而导致PBMC层得率减小，及粒细胞层污染。
②自行配置红细胞裂解液，可参考下表：
（不论是配的还是买的，使用浓度为1×，保存液一般为10×）
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二、血液样本的收集
紫色EDTA抗凝管收集的新鲜血液样本，室温18-22℃保存，务必当天完成操作
注：
①立即处理可产生最佳效果，最长不易超过8 h，越快越好；
②如果抽血和分离之间的延迟>1 h，可将抗凝管保存在冰上，并在分离处理前加热至18-22℃复温，较长时间的延迟会损害粒细胞和单核细胞的活力；
③若后续实验不关注单核细胞群的活化等具体检测，亦可使用绿色肝素抗凝管；若比较关注免疫细胞功能性检测，推荐换为绿色肝素抗凝管；
④注意抗凝管中血量，过高过低，均会对后续免疫细胞检测有影响：
3 ml抗凝管——2 ml血液 10ml抗凝管——8 ml血液
三、PBMC样本的制备
1. 血液样本稀释：用不含Ca离子Mg离子的PBS或HBSS对样本进行2-4倍的稀释；
注：Ca离子Mg离子会激活粒细胞
2. 轻轻地将预稀释的血液放入铺好Ficoll-Paque plus的离心管中（1.2步骤比例推荐见下图）；
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3. 水平离心机，400xg，离心40 min，降速设为0或最低；
4. 离心后所得样本分层如下图：
① 最上层即为血浆，可分装保存用于后续实验，或直接吸取丢弃；
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② 第二层白膜层即为PBMC（单个核细胞层：包含单核细胞+淋巴细胞）；
③ 最下层深红色为粒细胞+红细胞层（留存，后面制备中性粒细胞时使用）
注：取第二层PBMC白膜层分群不清晰时，吸弃上清后，可以留一定体积白膜层上下的液体，注意后续充分洗涤即可
5. 洗涤：
① 洗液（PBS或HBSS）补满全管体积，300×g，5 min，弃上清；
注：洗涤细胞沉淀时，先加小体积（1 mL）重悬浮细胞，再补满洗液；
② 重复上一步操作1-2次，直至上清液透明；
注：上清液清晰透彻可保证血小板的清除干净，它们粘附在单核细胞上，会导致污染，并影响单核细胞活力和活化
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6. 重悬沉淀，待用即可，若有红细胞残留，可以短时5-8 min裂红。
注：一般10 ml裂红液足以清除90 ml血液制备的PBMC中的红细胞残留
四、单核细胞和淋巴细胞的制备
选择美天旎的有柱式磁珠分选对CD14+单核细胞进行阳性分选（130-050-201，CD14 MicroBeads, human，Miltenyi），被CD14磁珠标记，滞留在磁场中的细胞，洗脱后即为单核细胞；非磁珠结合的，直接流出的液体部分即为相对纯净的淋巴细胞。
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操作步骤，相应产品的说明书已写的非常详尽了，这里仅给大家介绍些特殊注意事项：
1. 从第三补得到的PBMC开始，4℃保存和操作，保持细胞活力；
2. 磁珠孵育为4℃，不可在冰上进行；
3. 厂家推荐搭配的分选柱为LS柱，制造商的说明是可用于10^7-2×10^9 个细胞。实验发现每个LS柱最多有1×10^8个PBMC是一个有效的理想选择，过多会堵塞柱子。
注：
除美天旎的磁珠阳选试剂盒外，还有很多的分离方法：
①贴壁培养粘附法：得率相对较低，且纯度往往低于50%，一般不推荐；
②阴性分选法：有可能会导致血小板污染，使单核细胞污染和活化，且影响活性；
③其他品牌的磁珠阳选法：由于没有分选柱，需要靠大磁珠并大量的富集在细胞表面，会过度激活单核细胞，且往往影响后续流式抗体的结合，影响结果的检测。
五、中性粒细胞的制备（*此部分全程在18-22℃操作，温度变化会激活粒细胞）
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1. 用巴氏管或移液枪，在不干扰底层红色沉淀的基础上，吸弃上层的Ficoll液体；
注：如果在清除过程中底部分层受到干扰，可以500×g离心5 min。
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2. 红细胞裂解液加满至50 ml， 500×g离心5 min；
注：迅速，避免长时间暴露于裂红液，会溶解粒细胞导致受损及出现“粘稠”。
3. 不涡旋，不弃液，直接将该管(命名为管0)顶部20 ml转到新离心管1，再将接下来顶部的20 ml转移到新管2；
4. 管1和2加入30 ml裂红液，管0加入40ml裂红液（即分别加入裂红液补满管50 ml），孵育5min；
5. 500×g离心5 min；
6. 轻轻除去上清液，用1 ml 裂红液重悬细胞沉淀；
7. 可以最多将6管上一步骤6得到的细胞悬液混合在一起，用裂红液补至50 ml，孵育5 min；
8. 500×g离心5 min；
注：如果此时沉淀白色或在白色沉淀上方仅包含一个红色薄环，则进行下一步骤9，如果沉淀保持红色，重复步骤7、8消除红细胞。
9. 吸弃上清，用15 ml PBS清洗细胞沉淀；
10. 500×g离心5 min；
11. 吸弃上清，在PBS中重悬细胞（1~5×10^6细胞/mL）。
注：通常，50mL的血液可以产生5~20×10^7的中性粒细胞。
参考文献
[1] Cui C , Schoenfelt K , Becker K , et al. Isolation of polymorphonuclear neutrophils and monocytes from a single sample of human peripheral blood.[J]. STAR protocols, 2021, 2(4):100845.
[2] Mccoy J P . Handling, Storage, and Preparation of Human Blood Cells[M]. John Wiley & Sons, Inc. 2001.
