文章背景
Reference:OMIP-069: Forty-Color Full Spectrum Flow Cytometry Panel for Deep Immunophenotyping of Major Cell Subsets in Human Peripheral Blood
OMIP是国际流式学会旗下Cytometry PART A杂志中的专栏，全称为：Optimized Multicolor Immunofluorescence Panels。目的是为多色方案的科研人员提供素材，减少其方案的开发时间，提高实验效率。
一、实验背景
为了理解免疫逃避的机制和途径，无论是在免疫治疗后还是在对癌症、自身免疫和传染病的自然免疫反应中，都需要能够更深入地了解免疫系统的方法和方案。免疫亚群的更大特征可以在确定可靶向生物标志物和开发新的治疗方法方面做出更明智的决定。
解开人类免疫反应的复杂性需要在单细胞和群体水平上进行高通量、深入分析的能力。流式细胞术试图通过结合荧光标记的抗体来表征单细胞蛋白表达，从而满足这一需求到特定的感兴趣的标记。
OMIP中展示的小组检查了CD4和CD8 T细胞，调节性T细胞(Tregs)， γδ T细胞，nkt样细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、嗜碱性细胞、先天淋巴样细胞(ILCs)和树突状细胞。额外的标记允许表征主要的B细胞和T细胞亚群-幼稚，记忆和效应-以及假定的T辅助亚群。使用活性染料(Live/Dead Fixable Blue)排除死细胞。
二、种属与细胞类型
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三、配色与分群
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四、圈门策略
本文提出了一种用于识别主要细胞亚群的门控策略。
1.在排除双链细胞和死亡细胞后，嗜碱性粒细胞被描述为CD45+ CD123+ HLA-DR-。
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2.淋巴细胞和单核细胞基于FSCA/SSC-A特性进行门控。
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3.单核细胞通过CD14和CD16表达分为：
非经典细胞CD14−CD16+；
中间细胞CD14+ CD16+/low；
经典细胞CD14+ CD16-。
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4.从淋巴细胞门中，鉴定出以下群体：
CD3−TCRγδ−、CD3+ TCRγδ+和CD3+TCRγδ−。
CD3+ TCRγδ+群体基于CD45RA和CCR7的表达进行表征；
CD3+TCRγδ−群体分为CD3+ CD56+（NKT-like）和CD3+CD56−亚群。
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5.CD2和CD8的加入使NKT样细胞能够进一步分类。
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6.从CD3+CD56−门中鉴定出CD4+、CD8+、CD8+、CD4+和CD4−CD8−T细胞。
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7.利用CD127和CD25表达（CD127lo/-CD25hi）从CD4+群体中鉴定出treg，并使用CD39和CD45RA对这些细胞进行进一步分类。
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8.CCR7、CD45RA、CD27和CD28允许进一步对记忆/效应CD4和CD8 T细胞亚群进行进一步分类。
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9.CD19+和/或CD20+细胞（B细胞）从CD3−TCRγδ−群体中分离出来；
CD19+CD20+/−细胞进一步门控为IgD+CD27−、IgD+ CD27+或IgD−CD27+/−；
将IgD−CD27+/−亚群分为浆母细胞或IgD−记忆B细胞，并在IgD记忆B细胞中评估IgG和IgM的表达。
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10.NK细胞被定义为CD3−TCRγδ−CD56+ CD16+；末端NK：CD56−CD16+细胞。
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11.首先通过CD3−CD19−CD56−CD14−HLA-DR+门控鉴定树突状细胞（DCs），然后再鉴定出CD123+（pDCs）和CD11c+树突状细胞。CD11c+树突状细胞进一步分为CD16−和CD16+。
使用CD1c和CD141对CD11c+CD16−和CD11c+CD16+DC进行进一步分类。
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12.先天淋巴样细胞（ILCs）被鉴定为CD3−CD19−CD20−CD14−CD123−CD127+，并基于CD2和CD4的表达进行亚群化。
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13.对来自四个供体的PBMCs进行高维数据分析，显示FlowSOM簇投射到两个UMAP维度上，以显示手动和自动分析技术之间的一致性。覆盖图显示了来自所有四个样本的串联事件，而密度图显示了单个样本之间的种群分布的差异。通过高分辨率和高维数据的组合，一些集群包含了逃避规范定义的事件，这些种群以灰色显示。
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