文章背景：
Reference：Ferrer-Font L, Pellefigues C, Mayer JU, Small SJ, Jaimes MC, Price KM. Panel Design and Optimization for High-Dimensional Immunophenotyping Assays Using Spectral Flow Cytometry. Curr Protoc Cytom. 2020 Mar;92(1):e70. doi: 10.1002/cpcy.70. PMID: 32150355.
一、实验背景
本文重点根据光谱流式细胞术的具体特点，希望通过全面的步骤指导，帮助完成构建，设计和优化高维光谱流式panel的全过程。其中特别关注的内容，包括较大补偿的的染料使用，最佳的指标-荧光素搭配的逻辑选择过程。通过一个成功设计和优化三激光Aurora光谱流式细胞仪的高维方案步骤指引，以及一篇25色高维光谱流式案例展示加以说明。后续还可使用高维数据分析算法(例如tSNE、SPADE、FlowSOM等)进一步分析。
二、高维光谱流式细胞仪方案设计的步骤指引
STEP-BY-STEP PROTOCOL TO DESIGN HIGH-DIMENSIONAL PANELS FOR SPECTRAL FLOW CYTOMETRY
遵循以下的简单步骤指引，帮助设计一个适用于高维光谱流式细胞仪的panel
图1. 高维光谱流式细胞仪方案设计步骤解析
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1. 实验问题
确定研究的目的和假设：
Ø 实验的目的是什么(例如，DSS结肠炎期间T细胞中IL-17A和CXCR4表达是否增加?
Ø 需要哪些数据来验证你的假设?哪些读数比其他读数更重要?(MFI计数……)
Ø 哪些组织需要分析?与组织相关的限制是什么?(如消化，组织稳定性，自身荧光)
2. 了解生物学特性
我们建议使用表格进行整理，如细胞亚群表(表2)使新方案所有目标抗原变得可视化，然后将抗原列在第二张表中，称为抗原表(表3)，重点关注共表达的marker
3. 定义荧光团
可以使用在线荧光光谱查看器(例如BD, cyteck等)评估荧光团的光谱特征，或者通过获取单染色对照来手动评估特征。此外，还应考虑荧光团的亮度。
4. 为每个marker分配荧光素
通过将较亮的荧光团与较弱的表达水平相结合，始终将荧光团亮度与抗原表达水平相匹配，共表达marker和用于功能读数的marker应与补偿较小的荧光素相匹配。
图2.(A)三激光Aurora (Cytek) 53种常用染料的染色指数。(B) 24个独特荧光团的交叉染色指数(CSI)矩阵
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表1.Panel Table.此表可用于预测共表达maeker引发的扩散。
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5. 回顾理论方案设计
为了在进行实际测试之前对方案进行理论验证，审查方案时建议提出以下问题：
Ø 补偿较大的荧光素是否分配给非共表达标记？
Ø 需用于读数的marker是否获得最小的补偿？
Ø 荧光素亮度和抗原表达水平是否匹配良好？
三、光谱方案设计中的关键参数
a) 抗体滴定
抗体滴定是开发成功的高维光谱细胞仪方案的绝对要求，优化抗体滴定是必要的，以减少抗体的使用量，通过最小化非特异性结合来减少背景信号，并准确地比较样品。
b) 报告基因
为了准确检测报告基因表达，应在从报告系统中诱导最高基因表达水平的实验条件下(例如，刺激)获得单染对照，而所有其他单染色应来自野生型细胞。此外，全染的野生型细胞可作为全染的基因报告样本的荧光负一(FMO)对照。
四、25色高维光谱流式案例展示
1) 实验问题
实验目的是为了解在使用三重报告基因Basoph8x4C13R小鼠的MC903诱导的特应性皮炎模型中，哪些细胞类型表达IL-4和IL-13。
2) 生物学特性
我们在细胞亚群表(表4)和抗原表(表5)中注释了相关的细胞亚群、克隆、读出特征、抗原密度和荧光团可用性。
表2.细胞亚群表，细胞亚群，谱系标记和共表达表型列出。
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表3.抗原表。抗原，读出类型，克隆，抗原密度和荧光团可用性列出。
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3) 了解仪器和光谱特征
本实验使用Cytek 3L Aurora。通过使用在线荧光光谱观察器，我们能够识别25种具有不同特征的染料，可以用于我们的方案。
4)给荧光素分配marker
表4。用于检测皮肤免疫细胞2型细胞因子表达的25色方案示例。
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表格中首先填满了报告标记(红色)，然后是基本或稀有标记(橙色)，然后是用黄色、蓝色和白色突出显示的不同谱系标记。
4) 方案预览
该方案中使用的几对染料受到它们之间显着的扩散误差的影响(例如AF647/APC和BB515/YFP)。然而，通过将这些荧光素分配给非共表达的标记物(例如，用于AF647和APC的CD206和CD200R3)，这种影响得到了缓解。
5) 方案测试和优化
在未受刺激的耳皮肤上测试方案显示，所有的部分都可以被充分分辨(见圈门逻辑图)。然而，在皮肤的实验炎症过程中，检测到一些巨噬细胞IL-4的表达，造成IL-4 (AmCyan)和MHCII (Pacific Blue)之间的扩散误差。
因此，我们将MHCII-Pacific Blue的浓度从1/2000降低到1/10000。这一变化大大提高了巨噬细胞上IL-4表达的分辨率，而不损害我们检测其他MHCII+细胞类型(如树突状细胞)的能力(图8)。
图8.Pacific Blue MHCII在AmCyan通道的扩散。
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对MC903处理的野生型(WT)耳皮肤的分析显示，CD45+ CD64+ CD11b+巨噬细胞高表达MHCII阻碍了报告小鼠IL-4-AmCyan的检测。
将MHCII-Pacific Blue抗体的浓度从1/2000(左图)降低到1/10000稀释(右图)确实通过减少Pacific Blue进入AmCyan通道的扩散误差来提高IL-4的检测。
6) 圈门策略
1.CD45+ 白细胞和YFP+ 嗜碱性粒细胞是由活的单细胞门控的，进一步圈门，同时分析相关免疫细胞IL-4、IL-13的表达情况。
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2.CD64+ CD11b+巨噬细胞由Ly6C+炎症亚群和两个Ly6C lo亚群MHCII hi或CD206 hi组成
中性粒细胞：从CD64lo群体中，中性粒细胞为CD11b+Ly6G+
树突状细胞：在Ly6G-群体中，树突状细胞被定义为MHCII+ CD11c+
嗜酸性粒细胞与B细胞：CD11clo亚群中的SiglecF+ SSChi细胞，CD19+为B细胞。
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3. T细胞鉴定：
在Ly6G- CD11clo SiglecF- CD19-群体中，鉴定出TCRβ+ CD3+ T细胞和CD3+ TCRβ- T细胞。αβT细胞含有NK1.1+ NKTs、CD8+、CD4+和CD4- CD8-双阴性(DN) T细胞。
CD4+亚群进一步包含CD25+ T细胞群。
TCRβ- 细胞群可分为两个γδT细胞亚群，包括CD3/CD90.2/γδTCRvhi树突状表皮T细胞群(DETC)。
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4. CD3阴性亚群分为NK1.1+ NK细胞、CD11b+ Ly6C+炎性单核细胞、CD11b- Ly6C- CD117+ CD200R3+肥大细胞或Lineage - CD90.2+ CD25+ ILC2s
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