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【光谱系列11】设计、优化和标准化评估黑色素瘤患者t细胞免疫表型的高维光谱流式检测

Reference:Design, optimisation and standardisation of a high-dimensional spectral flow cytometry workflow assessing T-cell immunophenotype in patients with melanoma

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一、背景信息

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二、绝对计数、静息、活化Panel markers

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三、实验结果

1、27色静息方案的门控,对T和NK细胞的表面和细胞内标记进行检测。

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单个活淋巴细胞在分裂为B细胞(CD19+)、T细胞(CD3+)和NK细胞(CD19-CD3-CD16/56+)之前依次进行门控。根据CD16和CD56的差异表达,进一步分离NK细胞亚群。

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 TCRγδ+ T细胞在TCRγδ-亚群上的CD4和CD8门控之前被定义。CD4+ Treg细胞(CD25+CD127/lo)在从非Treg门控制记忆群体之前被排除。CD4+和CD8+ T细胞的记忆群体被定义为幼稚(CD45RA+ CCR7+ CD95lo)、干细胞样记忆(Tscm;CD45RA+CCR7+CCRCD95hi)、中央记忆(Tcm;CD45RA-CCR7+)、效应记忆CD45RO(TemRO;CD45RA-CCR7-)和效应记忆CD45RA(TemRA;CD45RA+CCR7-)。循环中的CD4+ Tfh细胞被定义为CD45RA-CXCR5+。

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2、20色激活方案的门控,用于检测CD3/cd28刺激的T细胞产生的细胞因子。

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事件按门控顺序选择单个的、活的淋巴细胞。由于一些样本中CD3下调,在TCRγδ+细胞门控之前,T细胞从T和NK细胞门(CD19-CD3+/- )进行门控。

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CD4+和CD8+ T细胞亚群分别被门控为CD19-TCRγδ-CD4+或CD19-TCRγδ-CD8hi(NK细胞为TCRγδ-CD8-/loCD4-)。Treg被门控为CD25+CD127-/lo,随后的CD4+ T记忆和th细胞从“非Treg”门进行门控。Th细胞亚群由典型的细胞因子表达(Th1、IFNγ+;Th17、IL-17A+;和Th2、IFNγ-IL-17A-IL-4+)来定义。CD4+和CD8+T细胞记忆亚群由CD45RA、CCR7和CD95的差异表达作为静息Panel。

3、高维分析显示,黑色素瘤患者的幼稚t细胞亚群减少,γδT细胞表型改变。

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(a)静息Panel UMAP图与群体标记表达的热图覆盖。

(b) X-shift聚类叠加联合对照组和患者Resting Panel数据,所有标记物的列尺度中位荧光强度(MFI)和患者和对照组对每个聚类的贡献百分比。使用热图中表示的群体标记对T细胞进行聚类。

(c)激活的Panel UMAP图与群体标记物表达的热图覆盖。

(d) X-Shift聚类覆盖和激活Panel聚类的中位数表达。x位图上手动绘制箭头表示CD4和CD8 T细胞从幼稚效应记忆到终分化效应记忆的进程。

4、静息和激活的Panel有助于黑色素瘤患者t细胞室的深入免疫表型

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(a)主要T细胞亚群的绝对计数显示患者的αβT细胞丰度减少,主要归因于CD4 T细胞的减少。CD8 (b)和CD4 (c) T细胞亚群的相对和绝对计数显示,幼稚细胞和Tfh细胞显著减少。

(d)Ki67在CD4和CD8t细胞亚群中的差异表达,包括耗尽(Exh.)。PD-1+ TIGIT+ TIM-3hi CD8 T细胞。

(e)耗尽的CD8 T细胞中Ki67染色的例子(f)CD4和CD8 T细胞亚群中IL-2的差异表达。

 

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