Reference:Design, optimisation and standardisation of a high-dimensional spectral flow cytometry workflow assessing T-cell immunophenotype in patients with melanoma
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一、背景信息
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二、绝对计数、静息、活化Panel markers
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三、实验结果
1、27色静息方案的门控，对T和NK细胞的表面和细胞内标记进行检测。
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单个活淋巴细胞在分裂为B细胞（CD19+）、T细胞（CD3+）和NK细胞（CD19-CD3-CD16/56+）之前依次进行门控。根据CD16和CD56的差异表达，进一步分离NK细胞亚群。
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TCRγδ+ T细胞在TCRγδ-亚群上的CD4和CD8门控之前被定义。CD4+ Treg细胞（CD25+CD127/lo）在从非Treg门控制记忆群体之前被排除。CD4+和CD8+ T细胞的记忆群体被定义为幼稚（CD45RA+ CCR7+ CD95lo）、干细胞样记忆（Tscm；CD45RA+CCR7+CCRCD95hi）、中央记忆（Tcm；CD45RA-CCR7+）、效应记忆CD45RO（TemRO；CD45RA-CCR7-）和效应记忆CD45RA（TemRA；CD45RA+CCR7-）。循环中的CD4+ Tfh细胞被定义为CD45RA-CXCR5+。
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2、20色激活方案的门控，用于检测CD3/cd28刺激的T细胞产生的细胞因子。
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事件按门控顺序选择单个的、活的淋巴细胞。由于一些样本中CD3下调，在TCRγδ+细胞门控之前，T细胞从T和NK细胞门(CD19-CD3+/- )进行门控。
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CD4+和CD8+ T细胞亚群分别被门控为CD19-TCRγδ-CD4+或CD19-TCRγδ-CD8hi（NK细胞为TCRγδ-CD8-/loCD4-）。Treg被门控为CD25+CD127-/lo，随后的CD4+ T记忆和th细胞从“非Treg”门进行门控。Th细胞亚群由典型的细胞因子表达（Th1、IFNγ+；Th17、IL-17A+；和Th2、IFNγ-IL-17A-IL-4+）来定义。CD4+和CD8+T细胞记忆亚群由CD45RA、CCR7和CD95的差异表达作为静息Panel。
3、高维分析显示，黑色素瘤患者的幼稚t细胞亚群减少，γδT细胞表型改变。
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(a)静息Panel UMAP图与群体标记表达的热图覆盖。
(b) X-shift聚类叠加联合对照组和患者Resting Panel数据，所有标记物的列尺度中位荧光强度（MFI）和患者和对照组对每个聚类的贡献百分比。使用热图中表示的群体标记对T细胞进行聚类。
(c)激活的Panel UMAP图与群体标记物表达的热图覆盖。
(d) X-Shift聚类覆盖和激活Panel聚类的中位数表达。x位图上手动绘制箭头表示CD4和CD8 T细胞从幼稚效应记忆到终分化效应记忆的进程。
4、静息和激活的Panel有助于黑色素瘤患者t细胞室的深入免疫表型
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(a)主要T细胞亚群的绝对计数显示患者的αβT细胞丰度减少，主要归因于CD4 T细胞的减少。CD8 (b)和CD4 (c) T细胞亚群的相对和绝对计数显示，幼稚细胞和Tfh细胞显著减少。
(d)Ki67在CD4和CD8t细胞亚群中的差异表达，包括耗尽（Exh.）。PD-1+ TIGIT+ TIM-3hi CD8 T细胞。
(e)耗尽的CD8 T细胞中Ki67染色的例子(f)CD4和CD8 T细胞亚群中IL-2的差异表达。
