一、磷酸化蛋白的意义
磷酸化主要发生在底物蛋白的酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸残基上，引起蛋白构象改变，进而动态调节蛋白酶活性及蛋白与蛋白之间的相互作用，导致次序蛋白磷酸化级联反应，将信号快速传递，最终调控与生命活动密切相关的各种事件，如：细胞代谢、生长、增殖、凋亡等。癌症、感染、炎症等。
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二、磷酸化蛋白检测的方法学
一种将流式细胞分析与磷酸化抗体免疫识别相结合的方法，称为蛋白磷酸化流式细胞分析技术（「Phospho-specific Flow Cytometry」，实现了从单细胞、细胞亚群、细胞群体各层次上进行多参数分析，具有快速、灵敏、准确、高通量、细胞用量少等特点，在肿瘤学、免疫学、疫苗开发、免疫治疗等研究领域得到了越来越广泛的应用。
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Phosflow技术VS WB技术
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三、实验思路设计Schematic representation of Phosflow assay
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四、肿瘤药物-实验案例说明
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实验workflow
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外挂1：刺激剂的选择
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细胞信号传导事件以快速的动力学形式发生。在37°C下，大多数反应在1-30分钟后最大，之后磷酸化水平迅速下降。最佳磷酸化反应所需的刺激时间可能随细胞类型、刺激和细胞信号分子的不同而不同。应及时给与细胞固定处理。
外挂2、指标抗体清单，验证过，放心用
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外挂3、FCB（Fluorescent cell barcoding）条形码
荧光细胞条形码(FCB)通过将多个样品混合在一个试管中进行进一步染色和分析，从而实现高通量多参数流式细胞术。
实验使用不同浓度的共价结合荧光染料进行细胞标记，因此样品被打上“条形码”，并根据荧光发射波长和强度进行区分每种细胞。
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多种打上“条形码”的样本可以混合在一起，然后在同一个试管中用抗体进行染色、上机、分析等流程。
FCB最大限度地减少染色变异性，抗体消耗和所需的总样本量。
免疫细胞FCB实验可以在新鲜全血、外周血单个核细胞(PBMC)或冷冻保存的PBMC上进行表型分析。
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样本1未受刺激，样本2被刺激，样本3在刺激前用小分子抑制剂处理。
① 固定后，细胞被冷甲醇破膜，用磷特异性抗体清洗和染色。在FCB技术（右侧）中，每个样品都被含有不同浓度的胺反应性荧光染料（FCB标记物）标记&冷甲醇破膜，为每个样品产生独特的荧光特征。
② 然后将样品清洗，合并到一个试管中，并用抗体染色。
③ 在对采集的数据进行软件分析时，根据其FCB标记将样本解压回原始样本。
④ 测量每个样品中磷酸化特异性抗体的荧光。在图中，虚线表示自身荧光，红色直方图表示样品荧光。
荧光细胞条形码(FCB)具体使用步骤&用量，请参考：
https://mp.weixin.qq.com/s/_UiDLhNRVrBfeWMokQyyaQ
外挂4、圈门策略gatting
时间线性门，排黏连，去死活：
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T细胞主群：CD3,CD4,CD8：
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T细胞亚群：Treg，Tn，Te，TeM, TcM：
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T细胞功能：耗竭PD-1, 活化CD69
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大数据可视化结果：
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a图：通过降维分析t-SNE&UMAP图，展示了来自健康供体和CLL患者的外周血单个核细胞（PBMCs）样本中的B细胞、T细胞和NK细胞6各不同亚群的占比。
b图：来自一名健康供体和一名CLL患者的PBMCs用抗igm刺激0-5 min。
使用t-SNE展示AKT（pS473）在不同样本中的表达丰度、信号强度，高亮区域表明AKT（pS473）在CLL病人的B细胞是较高表达。
Reference:
Immunophenotyping with (phospho) protein profiling and fluorescent cell barcoding for single-cell signaling analysis and biomarker discovery.
