免疫荧光实验概述

免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光（IF）技术就是将不影响抗原抗体活性的

荧光色素标记在抗体(或抗原)上，通过抗体识别和荧光成像技术结合起来，以直观观察固定细胞或组织样本中的靶蛋白和其他生物分子。这一过程可以揭示靶蛋白的定位、相对表达甚至激活状态。

在IF实验中，通常采用两种方式来检测靶蛋白：

（1）直接使用与荧光基团共价偶联的一抗（直接检测）；

（2）分成两步进行，即先用未标记的一抗，在使用与荧光基团偶联的二抗（间接检测）。

不管哪种方式，IF实验中都可以采用多个荧光基团（多重分析），使IF成为研究蛋白共定位、亚细胞定位变化、细胞内蛋白的不同激活状态、识别不同的细胞亚群及作其他分析的不二之选。

IF实验可以主要包括以下几个步骤：

实验设计 →样品制备 →固定 → 通透 → 封闭 → 免疫染色 → 复染 →封固样本 →成像分析

1、实验设计

所有的实验在开始之前都需要做好实验设计，以帮助更好的帮助判断实验结果，IF的实验设计更是如此，实验之前需要做好实验对照设计、选择合适的抗体和荧光基团等。

实验对照有阴性对照和阳性对照，阴性对照一般是用天然低表达、处理对照或者同型对照，阳性对照则用天然高表达或处理对照等。

常用同型对照产品推荐：

货号	产品	规格
3900S	Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control	250μg
5415S	Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control	250μg
61656S	Mouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control	100μl
53484S	Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control	100μl
37988S	Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control	100μl

常用的荧光二抗推荐：

货号	产品	规格
4408S	Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate)	250μl
4409S	Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate)	250μl
8890S	Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 594 Conjugate)	250μl
4410S	Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate)	250μl
4412S	Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate)	250μl
4413S	Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate)	250μl
8889S	Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 594 Conjugate)	250μl
4414S	Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate)	250μl
4416S	Anti-rat IgG (H+L), (Alexa Fluor® 488 Conjugate)	250μl
4417S	Anti-rat IgG (H+L), (Alexa Fluor® 555 Conjugate)	250μl
4418S	Anti-rat IgG (H+L), (Alexa Fluor® 647 Conjugate)	250μl

2、样品制备

免疫荧光根据样本不同分为细胞免疫荧光、冰冻切片免疫荧光和石蜡切片免疫荧光3种，不同的样本样品制备时有所差异，适用的抗体也不同，可以根据样本的不同稍作调整，选抗体是也要注意这一点。

3、封闭

封闭可以减少一抗和二抗与非靶标位点进行非特异性结合时所产生的本底信号。一般情况下可以使用5%正常山羊血清(或使用与二抗同物种来源的血清)作为封闭液。如果需要进一步提高信噪比降低背景，可以使用11932S。

货号	产品	规格
12411S	mmunofluorescence Blocking Buffer	50ml
11932S	Image-IT® FX Signal Enhancer	10ml

4、复染

IF实验过程中需要使用复染剂对细胞核细胞骨架等染色，更好的明确靶点定位等特征。

常用的复染试剂推荐：

货号	产品	规格
4083S	DAPI	1mg
4082S	Hoechst 33342	25mg
4087S	Propidium Iodide (PI)/RNase Staining Solution	100ml
4084S	DRAQ5®	50μl
8878S	Alexa Fluor® 488 Phalloidin	300次
8953S	Alexa Fluor® 555 Phalloidin	300次
8940S	Alexa Fluor® 647 Phalloidin	300次